Для получения чистых препаратов пшеничного глиадина существует несколько методов. Основным из них является метод Осборна, принцип которого заключается в извлечении глиадина из пшеничной муки или из предварительно отмытой клейковины с помощью 60—70%-ного этилового спирта. После отгонки растворителя в вакууме при невысокой температуре (35°) выпавший глиадин многократно промывают эфиром и водой, вновь растворяют в 70%-ном спирте и повторяют все эти операции 2—3 раза. Для окончательной очистки и обезвоживания сырой препарат глиадина выдерживают в течение нескольких дней в этиловом спирте возрастающих концентрации (до абсолютного) и в сухом эфире. Получается сухой тонкий порошок чистого глиадина.
Первоначальный метод Осборна (Оsbornе, 1907) подвергался впоследствии различным изменениям (Кизель, Новиков и Сухоруков, 1931; Тrоеnsеgaard, 1931) и некоторые его модификации приобрели известность в качестве отдельных методов. Так, например, по методу Дилла и Алсберга (Dill, Аlsberg, 1925) глиадин извлекают из клейковины разбавленным спиртом (60%), раствор сгущают в вакууме и белок очищают, комбинируя высаливание его водными растворами хлоридов натрия и лития, с осаждением из спиртовых растворов при низкой температуре.
Многократная очистка указанными способами завершается переосаждением глиадина абсолютным спиртом и приводит к получению чистых препаратов, хорошо растворимых в 50—70%-ном этаноле. По методу В. Л. Кретовича (Кретович, 1937; см. также Белозерский и Проскуряков, 1951) глиадин извлекают из сырой клейковины 64—65%-ным спиртом, отгоняют в вакууме (при 35°С) растворитель, тщательно промывают белок ледяной водой, вновь перерастворяют его в спирте и, повторив указанные операции 2—3 раза, осаждают глиадин из спиртового раствора, разбавляя его 10-кратным объемом безводного ацетона. Осадок обезвоживают путем проведения через 96%-ный и абсолютный спирт, серный эфир и окончательно — в вакууме-эксикаторе. Этот метод позволяет получить неороговевшие препараты глиадина, более чистые, чем по Осборну.
Метод Блиша и Сандстедта (Вlish, Sandstedt, 1926) основан уже на ином принципе, чем метод Осборна и его модификации. Сырую клейковину сушат в вакууме при температуре 60—65°С, измельчают и обрабатывают 0,07 n уксусной кислотой. В этих условиях в раствор переходит только глиадин, а глютенин остается нерастворенным. К фильтрату добавляют хлористый литий или нейтрализуют его щелочью, причем глиадин выпадает в осадок, который растворяют в 60%-ном спирте и вновь осаждают белок избытком абсолютного спирта, содержащего немного эфира и хлористого лития. Очистку повторяют и после сушки в вакууме получается очень чистый препарат глиадина.
Третий принцип положен в основу получения глиадина методом Кука (Сооk, 1931). Сырую клейковину диспергируют в 30%-ном водном растворе мочевины, удаляют крахмал центрифугированием, высаливают глютенин сернокислым магнием (0,12—0,18 от насыщения) и осаждают глиадин путем разбавления дисперсии водой. После обезвоживания спиртом и эфиром получается препарат глиадина, растворимый в 60— 70%-ном спирте (раствор опалесцирует).
Описанные методы получения глиадина и особенно метод Осборна предложены давно, но и в настоящее время они применяются с теми или иными видоизменениями, преследующими главную цель — избежать, по возможности, денатурации белка, в процессе выделения и получить его в состоянии, наиболее близком к нативному. Уменьшение денатурации белка достигается, во-первых, проведением всех операций по его выделению при низких температурах (что резко снижает также скорость ферментативных процессов, изменяющих белок), а во-вторых, отказом от длительного обезвоживания белка органическими растворителями — спиртом, ацетоном, эфиром и др.,— способными значительно денатурировать белок. Вместо этого сушка препаратов проводится лиофильным способом, т. е. влага сублимируется из замороженного белка в вакууме. Преимущества «мягких» режимов выделения белков доказаны многими работами и в настоящее время все исследования белков проводятся при строгом соблюдении условий, предохраняющих их от денатурации. Например, в работе В. Л. Кретовича и сотр. (Кретович, Бундель, Мелик-Саркисян, Степанович, 1954) показано, что альбумины, и глобулины семян гороха, выделенные при низкой температуре и обезвоженные лиофилизацией, обладают ферментативной активностью (каталазной, пероксидазной, инвертазной, дипептидазной и карбоксилазной) в противоположность тем же белкам, но полученным по методу Осборна, и следовательно, в известной степени денатурированным. Несомненно, что и в отношении глиадина изменение обычных методов его выделения с учетом защиты от денатурации приведет к получению препаратов, больше отвечающих нативному состоянию этого белка.
Первоначальный метод Осборна (Оsbornе, 1907) подвергался впоследствии различным изменениям (Кизель, Новиков и Сухоруков, 1931; Тrоеnsеgaard, 1931) и некоторые его модификации приобрели известность в качестве отдельных методов. Так, например, по методу Дилла и Алсберга (Dill, Аlsberg, 1925) глиадин извлекают из клейковины разбавленным спиртом (60%), раствор сгущают в вакууме и белок очищают, комбинируя высаливание его водными растворами хлоридов натрия и лития, с осаждением из спиртовых растворов при низкой температуре.
Многократная очистка указанными способами завершается переосаждением глиадина абсолютным спиртом и приводит к получению чистых препаратов, хорошо растворимых в 50—70%-ном этаноле. По методу В. Л. Кретовича (Кретович, 1937; см. также Белозерский и Проскуряков, 1951) глиадин извлекают из сырой клейковины 64—65%-ным спиртом, отгоняют в вакууме (при 35°С) растворитель, тщательно промывают белок ледяной водой, вновь перерастворяют его в спирте и, повторив указанные операции 2—3 раза, осаждают глиадин из спиртового раствора, разбавляя его 10-кратным объемом безводного ацетона. Осадок обезвоживают путем проведения через 96%-ный и абсолютный спирт, серный эфир и окончательно — в вакууме-эксикаторе. Этот метод позволяет получить неороговевшие препараты глиадина, более чистые, чем по Осборну.
Метод Блиша и Сандстедта (Вlish, Sandstedt, 1926) основан уже на ином принципе, чем метод Осборна и его модификации. Сырую клейковину сушат в вакууме при температуре 60—65°С, измельчают и обрабатывают 0,07 n уксусной кислотой. В этих условиях в раствор переходит только глиадин, а глютенин остается нерастворенным. К фильтрату добавляют хлористый литий или нейтрализуют его щелочью, причем глиадин выпадает в осадок, который растворяют в 60%-ном спирте и вновь осаждают белок избытком абсолютного спирта, содержащего немного эфира и хлористого лития. Очистку повторяют и после сушки в вакууме получается очень чистый препарат глиадина.
Третий принцип положен в основу получения глиадина методом Кука (Сооk, 1931). Сырую клейковину диспергируют в 30%-ном водном растворе мочевины, удаляют крахмал центрифугированием, высаливают глютенин сернокислым магнием (0,12—0,18 от насыщения) и осаждают глиадин путем разбавления дисперсии водой. После обезвоживания спиртом и эфиром получается препарат глиадина, растворимый в 60— 70%-ном спирте (раствор опалесцирует).
Описанные методы получения глиадина и особенно метод Осборна предложены давно, но и в настоящее время они применяются с теми или иными видоизменениями, преследующими главную цель — избежать, по возможности, денатурации белка, в процессе выделения и получить его в состоянии, наиболее близком к нативному. Уменьшение денатурации белка достигается, во-первых, проведением всех операций по его выделению при низких температурах (что резко снижает также скорость ферментативных процессов, изменяющих белок), а во-вторых, отказом от длительного обезвоживания белка органическими растворителями — спиртом, ацетоном, эфиром и др.,— способными значительно денатурировать белок. Вместо этого сушка препаратов проводится лиофильным способом, т. е. влага сублимируется из замороженного белка в вакууме. Преимущества «мягких» режимов выделения белков доказаны многими работами и в настоящее время все исследования белков проводятся при строгом соблюдении условий, предохраняющих их от денатурации. Например, в работе В. Л. Кретовича и сотр. (Кретович, Бундель, Мелик-Саркисян, Степанович, 1954) показано, что альбумины, и глобулины семян гороха, выделенные при низкой температуре и обезвоженные лиофилизацией, обладают ферментативной активностью (каталазной, пероксидазной, инвертазной, дипептидазной и карбоксилазной) в противоположность тем же белкам, но полученным по методу Осборна, и следовательно, в известной степени денатурированным. Несомненно, что и в отношении глиадина изменение обычных методов его выделения с учетом защиты от денатурации приведет к получению препаратов, больше отвечающих нативному состоянию этого белка.